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龙图腾网获悉中国科学院合肥物质科学研究院申请的专利蛋白酶冷冻电镜样品的制备方法以及蛋白酶的结构解析方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN121141727B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-03-31发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202511697805.0，技术领域涉及：G01N23/2202；该发明授权蛋白酶冷冻电镜样品的制备方法以及蛋白酶的结构解析方法是由王俊峰;李明;张凯铭;李珊珊设计研发完成，并于2025-11-19向国家知识产权局提交的专利申请。

本蛋白酶冷冻电镜样品的制备方法以及蛋白酶的结构解析方法在说明书摘要公布了：本申请属于生物医药与蛋白质工程领域，具体涉及蛋白酶冷冻电镜样品的制备方法以及蛋白酶的结构解析方法。所述制备方法包括如下步骤：提供目标蛋白酶的酶液，加入目标蛋白酶的酶抑制剂，所得混合物经孵育后收集孵育产物上清；以及，吸取所述孵育产物上清制备冷冻电镜样品；所述目标蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，所述目标蛋白酶位于细胞膜，或和，所述目标蛋白酶依赖ATP。本申请在目标蛋白酶的酶液加入目标蛋白酶的酶抑制剂孵育之后再制备冷冻电镜样品，如此操作能够克服膜蛋白酶的解聚和蛋白可溶区不稳定的问题，实现在电镜观察中成功解析到全长的膜蛋白酶的冷冻电镜结构，为后续设计特异性的靶向药物提供了精准参考。

本发明授权蛋白酶冷冻电镜样品的制备方法以及蛋白酶的结构解析方法在权利要求书中公布了：1.一种蛋白酶冷冻电镜样品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤： 提供目标蛋白酶的酶液，加入终浓度为0.5mM的硼替佐米，所得混合物于冰上孵育30min，之后于13000rpm下离心10min，收集孵育产物上清；以及， 吸取所述孵育产物上清制备冷冻电镜样品； 所述目标蛋白酶的酶液的制备步骤如下： 1通过在NCBI上搜寻卢米尼亚甲烷球形菌MethanomassiliicoccusluminyensisB10的LonB全长基因，并进行大肠杆菌偏好的密码子优化，合成并构建到用于大肠杆菌的表达质粒pET21a上； 2将合成好的pET21a-LonB质粒转化到大肠杆菌BL21DE3的感受态细胞中，并涂布带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，挑取平板上的阳性转化子到LB液体培养基中，置于37℃的培养箱中进行扩大培养，待其OD值达到0.8之后，加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷并将培养温度调节为16℃进行诱导表达20h； 36000rpm离心10min收取表达后的大肠杆菌，加入裂解缓冲液1进行重悬，加入终浓度为1mgmL的溶菌酶在37℃的培养箱中震荡孵育10min，之后用超声破碎仪进行破碎20min；之后用8000rpm转速离心20min收取破碎后的含细胞膜的上清组分，加入预先配置好的组合去垢剂进行溶膜，所述组合去垢剂为DDM和CHS，DDM的终浓度为1wt%、CHS的终浓度为0.2wt%，置于4℃的旋转混合仪15rpm溶膜2h；之后用20000g离心1h收取上清组分于用裂解缓冲液2预先平衡好的镍柱进行孵育，之后分别用裂解缓冲液3和裂解缓冲液4进行洗杂处理，之后用洗脱缓冲液进行目的蛋白洗脱； 其中， 所述裂解缓冲液1的组成为：pH=7.5、20mMHEPES缓冲液，250mMNaCl，20mMMgCl2和5%甘油； 所述裂解缓冲液2的组成为：pH=7.5、20mMHEPES缓冲液，250mMNaCl，20mMMgCl2，5%甘油，0.03wt%的DDM，0.006wt%的CHS和5mM的咪唑； 所述裂解缓冲液3的组成为：pH=7.5、20mMHEPES缓冲液，250mMNaCl，20mMMgCl2，5%甘油，0.03wt%DDM，0.006wt%CHS，20mM咪唑； 所述裂解缓冲液4的组成为：pH=7.5、20mMHEPES缓冲液，250mMNaCl，20mMMgCl2，5%甘油，0.03wt%DDM，0.006wt%CHS，40mM咪唑； 所述洗脱缓冲液的组成为：pH=7.5、20mMHEPES缓冲液，150mMNaCl，20mMMgCl2，5wt%甘油，0.03wt%DDM，0.006wt%CHS和400mM咪唑； 4将从镍柱收集的洗脱液进行除核酸处理，将所述洗脱液流经提前用低盐缓冲液A平衡好的HiTrapQ柱，收集流穿组分即为去除核酸后的目的组分，之后用截留量为100kDa的超滤管对流穿组分进行浓缩到0.5mL，之后用预先用分子筛缓冲液平衡好的Superose610300increase柱进行凝胶过滤层析，收集峰下组分即为所需的膜蛋白酶LonB； 其中， 所述低盐缓冲液A的组成为：pH=7.5、25mMHEPES缓冲液，250mMNaCl，20mMMgCl2和0.03wt%GDN胶质细胞源性连接蛋白； 所述分子筛缓冲液的组成为：pH=7.5、25mMHEPES缓冲液，250mMNaCl，20mMMgCl2，0.03wt%GDN。

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