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龙图腾网获悉上海交通大学医学院申请的专利一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116042525B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-03-27发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202310160730.7，技术领域涉及：C12N5/09；该发明授权一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用是由何牮;周献超;孟梅设计研发完成，并于2023-02-23向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用在说明书摘要公布了：本发明提供了一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤1、预处理肝肿瘤组织；步骤2、分步酶解；利用酶溶液分步酶解步骤1中的预处理后的肝肿瘤组织，并过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液；步骤3、梯度离心；利用细胞分离液对细胞悬液进行梯度离心，分离免疫细胞和肝实质细胞；步骤4、红细胞裂解；用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀；步骤5、收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液。

本发明授权一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用在权利要求书中公布了：1.一种肝肿瘤组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1：预处理肝肿瘤组织； 步骤2：利用酶溶液分步酶解预处理后的肝肿瘤组织，过滤后收集每一步的酶解液，得到细胞悬液；所述酶溶液是质量浓度为0.1%~0.5%的II型胶原酶，其酶活单位不低于125CDUmg； 步骤3：4-8℃，300-400g条件下将步骤2得到的细胞悬液离心，沉淀重悬于2-3mL的预冷PBS中，制备成细胞分散液；在离心管中依次加入3mLPercoll分离液3、3mlPercoll分离液2和2~3ml的细胞分散液进行梯度离心；所述梯度离心的条件为400g，4℃，20~30min；离心后底层为免疫细胞红细胞，介于Percoll分离液3和Percoll分离液2的中间层为肝实质细胞层；分离并收集免疫细胞红细胞和肝实质细胞层； 步骤4：用红细胞裂解液对步骤3获得的免疫细胞进行红细胞裂解，并离心清洗，获得免疫细胞沉淀； 步骤5：收集步骤3中的肝实质细胞和步骤4中的免疫细胞沉淀，用细胞清洗液清洗后离心获得细胞沉淀，用细胞重悬液重悬细胞沉淀并过滤，得到所述肝肿瘤组织单细胞悬液； 所述步骤2包括如下步骤： 4-8℃条件下将步骤1所得的组织放入5-10mL酶溶液中，在酶溶液中用剪刀剪碎肿瘤组织至1-2mm3的尺寸，进行初步酶解；初步酶解的处理条件为：37℃下，水浴摇床孵育5-10min；孵育结束后利用70-100μm滤膜过滤，收集初步酶解的滤液； 沉淀继续加入5-10mL酶溶液进行二次酶解，37℃水浴摇床孵育5-10min；孵育结束后过滤，收集二次酶解滤液，和初步酶解的滤液混合，即得细胞悬液； 所述Percoll分离液2的制备方法为：Percoll细胞分离液和10xPBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10xPBS溶液按体积比3-4：7混匀得到Percoll分离液2； 所述Percoll分离液3的制备方法为：Percoll细胞分离液和10xPBS溶液按体积比9：1混合，得到Percoll分离液1；Percoll分离液1和10xPBS溶液按体积比1：1混匀得到Percoll分离液3。

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