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龙图腾网获悉北京小仙炖生物科技有限公司申请的专利燕窝特征性肽段、其筛选方法及应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115141254B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-03-27发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202210628516.5，技术领域涉及：C07K7/06；该发明授权燕窝特征性肽段、其筛选方法及应用是由王东亮;戴建业;郭伟恒;林小仙;苗树设计研发完成，并于2022-06-06向国家知识产权局提交的专利申请。

本燕窝特征性肽段、其筛选方法及应用在说明书摘要公布了：本发明涉及一种可用于燕窝真伪鉴定的特征性肽段，其包含21个肽段氨基酸序列。在进行燕窝真伪鉴定时，酶解待检品，再经还原、烷基化后，进行高效液相色谱分离，通过高分辨质谱分析，将得到的蛋白肽段与上述特征性肽段进行对比。本发明还提供上述特征性肽段的筛选方法。本发明从燕窝中鉴定出了21个特征性肽段，大大丰富了燕窝特征性肽段的数目，并且基于蛋白质组学技术，利用胶内酶切方法鉴定了不同分子量的燕窝蛋白和肽段，建立了一种燕窝特征性肽段的筛选方法。

本发明授权燕窝特征性肽段、其筛选方法及应用在权利要求书中公布了：1.一种燕窝真伪鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1待检品蛋白中加入裂解液，加入丙酮混合，收集沉淀；沉淀中加入四乙基溴化铵，使沉淀分散后，加入胰蛋白酶进行酶解；再经二硫苏糖醇还原，碘乙酰胺烷基化，得到蛋白质提取液； 2将步骤1得到的蛋白质提取液用流动相A溶解后进行高效液相色谱后，再进行高分辨质谱分析，其中，所述的高效液相色谱，流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液，流动相梯度洗脱程序如下：时间流动相A流动相B0-68min77%-94%6%-23%68-82min68%-77%23%-32%82-86min20%-68%32%-80%86-90min20%80% ； 3对高分辨质谱获得的数据进行检索分析，鉴定是否含有如SEQIDNo.1～21氨基酸序列所示的特征性肽段； 燕窝特征性肽段的筛选方法包括如下步骤： 1构建燕窝蛋白质溯源数据库：将来自不同产地的燕窝原料、不同品牌的燕窝成品以及不同掺假物的蛋白混合在一起，进行还原、烷基化以及胰酶酶切，进行定性蛋白质组学研究，并将研究得到的所有蛋白和肽段信息建立为燕窝蛋白质溯源数据库； 2筛选燕窝特征性肽段：对若干真实燕窝样品进行蛋白质组学研究，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经切胶、还原、烷基化以及胶内酶切，得到不同分子量的燕窝蛋白，经与步骤1的数据库分析对比筛选后得到如SEQIDNo.1～21氨基酸序列所示的特征性肽段； 燕窝特征性肽段的筛选方法的步骤1中定性蛋白质组学研究的方法包括： a取等量的各样品蛋白进行酶解，用裂解液将体积调整至一致；加入1倍体积的预冷丙酮，涡旋混匀后再加入4倍体积的预冷丙酮，在20℃沉淀2h；4500g，离心5min，弃上清，用预冷丙酮洗涤沉淀2次；晾干沉淀后加入终浓度200mM的四乙基溴化铵，超声打散沉淀，按蛋白酶与蛋白的质量比为1∶50的比例加入胰蛋白酶，酶解过夜；加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min；之后加入碘乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min，得到待测肽段； b步骤a得到的待测肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASYnLC1200超高效液相系统进行分离；流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液；液相梯度设置：0-68min6％～23％流动相B；68-82min23％～32％流动相B；82-86min32％～80％流动相B；86-90min80％流动相B，流速维持在500nLmin；肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后进入OrbitrapExplorisTM480质谱进行分析；离子源电压设置为2.3kVFAIMS补偿电压；一级质谱扫描范围设置为400-1200mz，扫描分辨率设置为60000；二级质谱扫描范围固定起点为110mz，二级扫描分辨率设置为15000，TurboTMT设置为Off；数据采集模式使用数据依赖型扫描程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前25肽段母离子依次进入HCD碰撞池，使用27％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析；自动增益控制设置为100％，信号阈值设置为5E4ionss，最大注入时间设置为Auto，串联质谱扫描的动态排除时间设置为20s避免母离子的重复扫描；二级质谱数据使用ProteomeDiscovererv2.4.1.15进行检索； 所述燕窝特征性肽段的筛选方法的步骤2中蛋白质组学研究的方法包括： A向不同的燕窝蛋白溶液中加入5×上样缓冲液，95℃金属浴处理5-10min；将煮好的样品加入SDS-PAGE中进行凝胶电泳，电压：0-15min80V；15-70min120V；将凝胶使用考马斯亮蓝染液染色并用脱色液脱色； B将已脱色并提取图片的胶用高纯水清洗两次，根据图片确定需要切的部分，准备1.5ml离心管；用乙醇冲洗离心管，静置后移去管底存液；用乙醇冲洗玻璃板，刀片和一个100μl枪头，静置待干；换新手套，将胶置于玻璃板上切下所需部分，并切成1-1.5mm见方的小粒，装进相应管子； C加500μl脱色剂稍作涡旋，低速震荡脱色；待胶粒全部为无色透明，离心并去除液体；加500μl脱水剂稍作涡旋，低速震荡10min或置于冰箱中脱水；待胶粒全部为白色，离心并去除液体；加10mM50μl二硫苏糖醇，56℃下孵育30-40min；离心去除液体；加55mM50μl碘乙酰胺室温下黑暗中孵育60min；离心去除液体，用500μl高纯水清洗胶粒，涡旋，离心去除液体；加500μl脱水剂，稍作涡旋，低速震荡10min，待胶粒为白色，离心并去除液体；按每1mm胶粒为1μl计，加足够的胰蛋白酶，放冰箱45-60min充分溶胀，按每1mm胶条2μl比例加入50mM碳酸氢铵，30℃孵育过夜，12-16h； D加50μl提取液：50％乙腈5％甲酸，室温下高速震荡25min，离心并将液体移入新标注好的1.5ml离心管；重复提取一次，合并提取液，真空离心浓缩； E上样前，将样品用液相色谱流动相A相溶解后15000rpm离心45min，取上清液至样品瓶；使用EASYnLC1200超高效液相系统进行分离；流动相A为含0.1％甲酸的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸的乙腈；液相梯度设置：0-2min4％～12％B；2-23min12％～30％B；23-27min30％～50％B；27-28min50％-100％B，流速维持在300nLmin；肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后进入OrbitrapFusionLumos质谱进行分析；离子源电压设置为2.2kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析；一级质谱扫描范围设置为375-1500mz，扫描分辨率设置为120000；二级质谱扫描范围固定起点为100mz，二级扫描分辨率设置为30000；二级质谱数据使用pFind3进行检索。

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