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龙图腾网获悉浙江省淡水水产研究所申请的专利一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN114959050B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-02-27发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202111527499.8，技术领域涉及：C12Q1/6888；该发明授权一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法是由刘士力;卞玉玲;刘一诺;贾永义;迟美丽;李飞;郑建波;程顺;顾志敏设计研发完成，并于2021-12-15向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法在说明书摘要公布了：本发明提供一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，属于生物工程技术领域，本发明包括以下步骤：1提取待测样本基因组DNA；2红螯螯虾微卫星引物的筛选3多重PCR扩增体系的构建将步骤2的20对引物按照120‑200bp、220‑260bp、280‑340bp、360‑420bp、440bp‑500bp的区间进行分组，选出扩增组合，获得多组多重PCR扩增体系；4亲子鉴定待测样本基因组DNA扩增，得到多重PCR产物，分型，读取亲本及子代基因型，判断亲子关系。本发明能够实现多种引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。在PCR扩增的过程中同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的，并且对红螯螯虾达到100％的亲子鉴定成功率。

本发明授权一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法在权利要求书中公布了：1.一种基于四碱基微卫星荧光多重PCR的红螯螯虾亲子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤； 步骤1红螯螯虾样本DNA提取： 取红螯螯虾个体的附肢，用酚-氯仿法提取待测样本基因组DNA； 步骤2红螯螯虾微卫星引物的筛选： 根据本实验室保存的红螯螯虾基因组序列，利用MISA软件筛选出20个四碱基微卫星序列： Cqaa-48，其核苷酸序列如序列1所示； Cqaa-191，其核苷酸序列如序列2所示； Cqaa-218，其核苷酸序列如序列3所示； Cqaa-197，其核苷酸序列如序列4所示； Cqaa-24，其核苷酸序列如序列5所示； Cqaa-181，其核苷酸序列如序列6所示； Cqaa-121，其核苷酸序列如序列7所示； Cqaa-227，其核苷酸序列如序列8所示； Cqaa-22，其核苷酸序列如序列9所示； Cqaa-163，其核苷酸序列如序列10所示； Cqaa-106，其核苷酸序列如序列11所示； Cqaa-185，其核苷酸序列如序列12所示； Cqaa-115，其核苷酸序列如序列13所示； Cqaa-182，其核苷酸序列如序列14所示； Cqaa-240，其核苷酸序列如序列15所示； Cqaa-228，其核苷酸序列如序列16所示； Cqaa-132，其核苷酸序列如序列17所示； Cqaa-211，其核苷酸序列如序列18所示； Cqaa-43，其核苷酸序列如序列19所示； Cqaa-167，其核苷酸序列如序列20所示； 利用PrimerPremier6.0软件针对20个四碱基微卫星序列设计微卫星位点引物，筛选出20对引物； 步骤3多重PCR扩增体系的构建： 将步骤2针对四碱基微卫星序列设计的20对引物按照120-200bp、220-260bp、280-340bp、360-420bp、440bp-500bp的区间进行分组，然后在不同组中选择3-5对引物，选出扩增组合，将每个位点上游引物的5'端进行荧光修饰，获得多组多重PCR扩增体系； 步骤4亲子鉴定： 基于步骤3构建的多组多重PCR扩增体系将步骤1所述的待测样本基因组DNA扩增，得到多重PCR产物，然后在测序仪上对多重PCR产物进行分型，读取个体等位基因大小bp，排成数字基因型矩阵，读取亲本及子代基因型，根据孟德尔定律判断亲子关系； 其中， 步骤3中，所述多组多重PCR扩增体系的引物组合由第一组、第二组、第三组、第四组、第五组引物组成；所述第一组引物由针对四碱基微卫星位点Cqaa-48、Cqaa-191、Cqaa-218、Cqaa-197、Cqaa-24设计的引物组成，所述第二组引物由针对四碱基微卫星位点Cqaa-181、Cqaa-121、Cqaa-227、Cqaa-22设计的引物组成，所述第三组引物由针对四碱基微卫星位点Cqaa-163、Cqaa-106、Cqaa-185、Cqaa-115设计的引物组成，所述第四组引物由针对四碱基微卫星位点Cqaa-182、Cqaa-240、Cqaa-228、Cqaa-132设计的引物组成，所述第五组引物由针对四碱基微卫星位点Cqaa-211、Cqaa-43、Cqaa-167设计的引物组成； 步骤4中，所述待测样本基因组DNA扩增的条件为：94℃总变性5分钟，94℃变性30秒，59℃下退火90秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后60℃延伸30分钟。

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