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龙图腾网获悉湖北和格复合骨胶原生物科技有限公司申请的专利一种增加骨密度和提高骨弹性的非变性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN120463799B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-02-03发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510822497.3，技术领域涉及：C07K14/78；该发明授权一种增加骨密度和提高骨弹性的非变性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法是由李佳设计研发完成，并于2025-06-19向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种增加骨密度和提高骨弹性的非变性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法在说明书摘要公布了：本发明提供一种增加骨密度和提高骨弹性的非变性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法，属于生物技术领域，本发明采用含有β‑巯基乙醇的EDTA‑柠檬酸缓冲液对软骨进行脱钙，采用超临界CO22萃取技术进行脱脂，采用碱性蛋白酶和胶原酶Ⅱ进行基质定向酶解，梯度消化；之后采用三相离心分离进行分离非变性Ⅱ型胶原蛋白，采用仿生H柱层析纯化，能够获得高提取率、高纯度、高结构完整性的非变性Ⅱ型胶原蛋白。

本发明授权一种增加骨密度和提高骨弹性的非变性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法在权利要求书中公布了：1.一种增加骨密度和提高骨弹性的非变性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： S1,脱钙：准备鸡胸软骨或鲨鱼鳍软骨，浸泡在EDTA-柠檬酸缓冲液，取出，冲洗，得到脱钙后软骨； 所述EDTA-柠檬酸缓冲液的浓度为0.5molL～0.6molL，并且含有1mmolL～1.5mmolLβ-巯基乙醇，pH值为6.7～6.9； S2,脱脂：脱钙后软骨超临界CO2萃取进行脱脂，取出，得到脱脂后软骨； S3，基质定向酶解：将脱脂后软骨加入含有碱性蛋白酶和胶原酶Ⅱ的Tris-HCl缓冲液中，梯度消化，具体为：首先进行振荡，然后静置，添加蛋白酶K抑制剂继续振荡，得到含有非变性Ⅱ型胶原蛋白的酶解液； 所述Tris-HCl缓冲液中含有5mmolL～6mmolLCaCl2、2mmolL～3mmolLZnCl2、0.001gmL～0.003gmL海藻糖、0.001gmL～0.002gmL碱性蛋白酶和0.0005gmL～0.0008gmL胶原酶Ⅱ，pH值为7.3～7.5； S4，三相离心分离： S4.1初次离心去残渣：离心分离残渣，得到上清液A； S4.2二次离心沉淀杂质蛋白：向上清液A中加入PEG，离心分离沉淀，得到上清液B； S4.3过滤：上清液B过滤，取滤液得到胶原蛋白溶液； S5，仿生纤维柱层析纯化：将胶原蛋白溶液上样到HA柱中，采用线性梯度洗脱方式采用NaCl水溶液梯度洗脱，收集合并不同浓度NaCl水溶液的洗脱液，得到纯化液； 所述HA柱为羟基磷灰石柱，且含有2wt%～4wt%透明质酸，模拟软骨细胞外基质ECM环境； S6，动态pH稳定化处理：纯化液调节pH；加入丙三醇；通过微流控装置以层流模式混合，得到目标蛋白液； S7，干燥，得到非变性Ⅱ型胶原蛋白。

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