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龙图腾网获悉潍坊吉涛医学科技有限公司;上海吉涛生物科技有限公司申请的专利一种NK细胞体外扩增培养基及其培养方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN120158426B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-01-06发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510645682.X，技术领域涉及：C12N5/0783；该发明授权一种NK细胞体外扩增培养基及其培养方法是由刘天津;刘凯年;黄欢设计研发完成，并于2025-05-20向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种NK细胞体外扩增培养基及其培养方法在说明书摘要公布了：本发明属于免疫细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞体外扩增培养基及其培养方法。其由基础培养基和辅助添加剂组成，所述基础培养基是X‑VIVO15培养基；所述辅助添加剂的组成包括下述组分：人血清白蛋白HSA、IL‑12、IL‑18、IL‑15、雷帕霉素、烟酰胺、明胶‑IL‑15微球、藻酸盐‑IL‑21微球、重组人胰岛素、转铁蛋白、谷氨酰胺、β‑巯基乙醇、非必须氨基酸和脂质混合物。本发明通过时序协同IL‑15缓释IL‑21脉冲释放、代谢协同NAD+‑线粒体脂质‑膜稳态，实现高效扩增与长效细胞毒性。

本发明授权一种NK细胞体外扩增培养基及其培养方法在权利要求书中公布了：1.一种NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，包括如下步骤： S1：抽取全血放入无菌肝素钠采血管中，颠倒数次混匀； S2：将步骤S1混匀的全血与等体积PBS溶液混合，缓慢叠加至Ficoll-PaquePLUS液面上，室温离心处理； S3：吸取步骤S2离心处理后的白膜层，加入PBS洗涤，离心处理，弃上清； S4：向步骤S3制备的离心物加入ACK裂解液，室温孵育，离心，弃上清，重复上述离心物加入ACK裂解液中，室温孵育，离心，弃上清的裂解操作1～2次； S5：将步骤S4离心物用PBS重复洗涤，重悬于含0.5%HSA的PBS缓冲液中，加入‌CD56+磁珠‌，混匀后室温孵育，PBS洗涤‌，离心处理，弃上清，重悬于含0.5%HSA的PBS缓冲液中，过磁柱收集CD56+细胞，然后重悬于含3%HSA的X-VIVO15培养基中，调整细胞密度至1×106～3×106cellsmL，获得细胞悬浮液； S6：将步骤S5制备的细胞悬浮液接种至T175培养瓶，静置处理，轻拍收集悬浮细胞； S7：将步骤S6制备的悬浮细胞重悬于含3%HSA的X-VIVO15培养基，调整细胞密度至0.5×106cellsmL，并添加活性因子，混合均匀后，转移至T175培养瓶中，孵育处理，获得预激细胞悬浮液； S8：将步骤S7制备的预激细胞悬浮液离心处理，弃上清，用含3%HSA的X-VIVO15培养基重悬细胞，并加入明胶-IL-15微球、藻酸盐-IL-21微球和烟酰胺，转移至T175培养瓶中，孵育培养，每日轻摇培养瓶； 所述明胶-IL-15微球的具体制备步骤如下： S101：将明胶于60℃水浴下以0.1g:10mL的比例溶解到PBS缓冲液中，加入0.2～0.5mgmLIL-15，混合均匀后，冷却至37℃，获得水相；将矿物油与1～2%Span80混合，预热至37℃，获得油相； S102：将步骤S101中制备的水相以1:4的体积比缓慢加入油相中，在37℃下，以800rpm搅拌处理30～60min，形成油包水乳液； S103：向步骤S102中制备的油包水乳液中缓慢加入0.05～0.1%戊二醛，37℃搅拌处理2～3h后，加入等体积4℃预冷丙酮，3000rpm离心10～15min，收集沉淀，PBS缓冲液重复洗涤至无戊二醛残留，获得明胶-IL-15微球； 所述藻酸盐-IL-21微球的具体制备步骤如下： S201：将海藻酸钠以0.2g:10mL的比例溶解于去离子水，加入0.5～1mgmLIL-21，混匀后0.22μm过滤除菌，获得藻酸盐-IL-21混合液；将藻酸盐-IL-21混合液装入G22针头注射器中，距离液面10cm，以恒定速度滴入0.1MCaCl2溶液中并以200rpm转速持续搅拌，滴加完成后静置30～60min，PBS缓冲液重复洗涤3次，获得藻酸盐-IL-21微球； S9：在S8启动扩增培养后的第2天，向培养瓶中加入含3%HSA的X-VIVO15培养基，调整溶液终体积，轻摇混匀后继续培养； S10：在S9扩增培养后的第3天至第11天，每48h进行一次重复培养处理； S11：在S8启动扩增培养后的第7天，立即向培养瓶中补液，轻摇混匀后继续培养； S12：在S8启动扩增培养后的第10天，停止所有细胞因子补充，补液时改用无血清培养基； S13：在S8启动扩增培养后的第14天，将细胞悬浮液转移至离心瓶中，离心处理，弃上清，DPBS重复离心洗涤，用生理盐水和营养保存液重悬细胞，分装至冻存管，缓慢降温，最终转移至液氮保存； 步骤S2中，所述离心处理参数为：转速400g，时间20～30min；步骤S7中，所述活性因子的添加浓度分别为：IL-12:5～10ngmL、IL-18:15～20ngmL、IL-15:10～15ngmL和雷帕霉素:6～10ngmL； 步骤S8中，所述离心处理参数为：转速500g，时间5～8min；所述明胶-IL-15微球的添加浓度为15～20μgmL；所述藻酸盐-IL-21微球的添加浓度为8～10μgmL；所述烟酰胺的添加浓度为1～5mM； 步骤S10中，所述重复培养处理的具体操作为：轻摇培养瓶后静置5min，吸弃上层50%培养基；然后补加等体积新鲜含3%HSA的X-VIVO15培养基；当细胞密度1.5×106cellsmL时，按1:2比例分装至新T175培养瓶中，再补加新鲜含3%HSA的X-VIVO15培养基； 步骤S11中，所述补液的具体操作为：补加IL-21至终浓度为50ngmL，6h后补加IL-18至终浓度为20ngmL； 步骤S12中，所述无血清培养基由OptiVitroT细胞无血清培养基和营养增补液按9.2:0.8的比例混合制备获得；所述营养增补液由下述成分组成：10～20μgmL重组人胰岛素、5～10μgmL转铁蛋白、2～4mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1%非必须氨基酸和0.1～0.5%脂质混合物； 步骤S13中，所述营养保存液由10%二甲基亚砜、10%HSA、5～10mM葡萄糖、5%右旋糖酐40和生理盐水配制获得。

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