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龙图腾网获悉湖南省微生物研究院申请的专利一种短短芽孢杆菌基于反向筛选标记pheS*的基因组无痕编辑方法与应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119685367B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-12-26发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411953336.X，技术领域涉及：C12N15/74；该发明授权一种短短芽孢杆菌基于反向筛选标记pheS*的基因组无痕编辑方法与应用是由龙青山;刘清术;唐滢;杜杰;张亮;郭照辉;黄彬彬;张翠央;李晔;黄军设计研发完成，并于2024-12-27向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种短短芽孢杆菌基于反向筛选标记pheS*的基因组无痕编辑方法与应用在说明书摘要公布了：本发明公开短短芽孢杆菌基于以pheS*基因作为反向筛选标记的基因组无痕编辑方法与应用。本发明的目的在于以Br.brevisX23为模式菌株，利用经定点突变的pheS*基因作为反向筛选标记建立的一种基因组无痕编辑方法及其应用。本发明为在该菌株中后续开展基础研究与应用研究提供一种强大且便利的遗传学操作工具，促进代谢工程、组合生物合成及合成生物学的发展。

本发明授权一种短短芽孢杆菌基于反向筛选标记pheS*的基因组无痕编辑方法与应用在权利要求书中公布了：1.一种土壤生防细菌短短芽孢杆菌基于以pheS*基因为反向筛选标记的基因组无痕编辑方法，其特征在于，包括以下步骤： S1利用重叠延伸PCR技术构建含P43启动子、携带突变位点的pheS基因和正向筛选标记基因，以及在P43启动子、pheS基因和正向筛选标记基因两两之间分别引入核糖体结合位点SD序列成为核心元件的PA基因表达盒；所述携带突变位点的pheS基因是指编码蛋白相对于Br.brevisX23菌株中PheS蛋白的A309G； S2利用重叠延伸PCR技术构建含PA基因表达盒与待删除基因相关同源臂的靶标DNA片段，称为LDPR片段，组装顺序依次为：待删除基因左侧600-2000bp区域的LF01片段、待删除基因下游500-1200bp区域作为正向重复序列的DR01片段、PA表达盒片段、紧邻LF01片段右侧的待删除基因之间600-1000bp区域的RF01片段； S3利用同源重组技术融合LDPR片段与Br.brevis-E.coli穿梭载体pBE194的骨架片段得到待删除基因的无痕编辑质粒pBE194-LDPR；其中Br.brevis-E.coli穿梭载体pBE194的骨架片段是用BamHISpeI双酶切或EcoRVSmaI双酶切穿梭载体pBE194而回收长度为4.8kb的载体骨架片段； S4将编辑质粒pBE194-LDPR电转化入短短芽孢杆菌，先通过抗性筛选得到整合到染色体上目标区域的过渡菌株，随后利用试剂p-Cl-Phe反向筛选得到删除掉染色体上的目标基因区域，同时消除质粒序列的目标菌株，实现X23基因组上真正彻底的无痕编辑。

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