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龙图腾网获悉山东大学申请的专利一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒的构建方法及其在基因编辑中应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116064631B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-11-07发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211459623.6，技术领域涉及：C12N15/70；该发明授权一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒的构建方法及其在基因编辑中应用是由高哲;袁冠华;田旭辉;佘群新;冯旭;倪维森设计研发完成，并于2022-11-17向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒的构建方法及其在基因编辑中应用在说明书摘要公布了：本发明涉及一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒的构建方法及其在基因编辑中应用。所述质粒是含有mini‑CRISPR簇及多供体DNA片段的基因编辑质粒pMHAGE。该质粒同时携带人工CRISPR簇和多个供体DNA，多供体DNA通过同源重组能够对可使用CRISPR‑Cas系统的原核生物进行多种形式的基因编辑，对大片段非必需基因区的识别和删除，实现原核生物基因组的精简。该质粒应用宿主范围广，所有可利用CRISPR‑Cas系统的细菌和古菌均可操作；可用于识别基因组上可删除大片段非必需基因区域及可编辑的非必需基因区组合；具有筛选生长表型及抗逆性最优的非必需基因区大片段删除的基因组精简底盘细胞能力；流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组精简时的工作量。

本发明授权一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒的构建方法及其在基因编辑中应用在权利要求书中公布了：1.一种识别并删除大片段非必需基因区的质粒，其特征在于，所述质粒是含有mini-CRISPR簇及多供体DNA片段的基因编辑质粒pMHAGE； 在原核生物基因组的拟编辑区域选取一段protospacer序列作为靶标位点，根据protospacer序列设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5’-AAG-Nn-3’，反向引物：5’-AGC-N’n-3’，其中Nn和N’n为反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C，n表示protospacer序列的碱基个数；将两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer片段；人工CRISPR载体pSe-Rp经过限制性内切酶LguⅠ酶切处理，然后与具有粘性末端的spacer片段经T4连接酶酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒pAC；再将用来识别删除目标区域非必需大片段所需的多供体DNA片段插入至能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒pAC上，得到含有多供体DNA的基因编辑质粒pMHAGE； 其中，所述的原核生物为含有内源I型和或Ⅲ型CRISPR-Cas系统的细菌或古菌、或导入内源I型和或Ⅲ型CRISPR-Cas系统的细菌或古菌； 所述的多供体DNA片段由与宿主细胞基因组的拟编辑区域靶标位点两侧多处同源的DNA片段通过SOE-PCR串联融合而成，其获得方法包括步骤如下： 1根据宿主细胞基因组的拟编辑区域靶标位点两侧多处同源的DNA片段，通过SOE-PCR的方式分别设计带有相邻供体DNA接头的各供体DNA片段的扩增引物，PCR扩增各供体DNA片段可以但不限于标记为HA1、HA2...、HAn； 2以相同摩尔浓度将各供体DNA片段等体积混合，在不加任何引物的条件下通过overlap-PCR方法扩增15~20个循环，得到融合片段； 3以第一个供体DNA片段扩增正向引物F1和最后一个供体DNA片段扩增反向引物Rn作为扩增引物，以步骤2所得的融合片段为模板，进行PCR扩增，经富集纯化后，得到多供体DNA片段，该多供体DNA片段为各供体DNA串联融合产物HA1-HA2-...-HAn； 其中，所述的多供体DNA大于等于3个，即HAn的n≥3。

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