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龙图腾网获悉湖南永和阳光生物科技股份有限公司申请的专利反向酶联免疫吸附检测方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN120294325B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-10-17发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510462406.X，技术领域涉及：G01N33/543；该发明授权反向酶联免疫吸附检测方法是由杨旭冉设计研发完成，并于2025-04-14向国家知识产权局提交的专利申请。

本反向酶联免疫吸附检测方法在说明书摘要公布了：本申请公开了反向酶联免疫吸附检测方法，属于生物医学检测技术领域。包括以下步骤：步骤1，对生物样本进行离心过滤和梯度稀释，同时准备未偶联的特异性抗体抗原和双酶标记二抗，优化试剂配比以确保最佳活性；步骤2，使待测样本与特异性抗体抗原竞争结合，加入双酶标记二抗与未被占据的抗体抗原结合位点结合，形成酶标复合物；步骤3，加入纳米磁性粒子，通过施加脉冲磁场促进复合物的高效捕获，形成完整免疫复合物；步骤4，利用梯度磁场分离免疫复合物，收集上清液相中未结合的酶标二抗的液相，并采用时间分辨荧光‑比色双模式检测其酶活性；步骤5，结合样本特异性校正因子精确计算目标抗原抗体浓度；步骤6，生成标准化检测报告。

本发明授权反向酶联免疫吸附检测方法在权利要求书中公布了：1.反向酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，对生物样本进行离心过滤和梯度稀释，同时准备未偶联的特异性抗体抗原和双酶标记二抗，优化试剂配比以确保最佳活性； 步骤2，在微流控反应腔中，使待测样本与特异性抗体抗原竞争结合，随后加入双酶标记二抗与未被占据的抗体抗原结合位点结合，形成酶标复合物； 步骤3，加入表面修饰有特异性抗体抗原的纳米磁性粒子，通过施加脉冲磁场促进复合物的高效捕获，形成完整免疫复合物； 步骤4，利用梯度磁场分离免疫复合物，收集上清液相中未结合的酶标二抗的液相，并采用时间分辨荧光-比色双模式检测其酶活性； 步骤5，基于酶活性数据反向计算已结合的酶标二抗量，结合样本特异性校正因子精确计算目标抗原抗体浓度； 步骤6，执行内部质控程序验证检测结果的准确性，生成标准化检测报告； 步骤3包括以下步骤： 将预先制备的表面修饰纳米磁性粒子注入微流控反应腔，以使磁性粒子表面通过EDCNHS化学交联法共价连接特异性抗体抗原，浓度控制在0.5-1mgmL，注入速率为2-3μLmin，确保磁性粒子在反应体系中均匀分散，避免聚集现象影响捕获效率； 启动微流控芯片底部集成的电磁线圈阵列，生成强度为0.2-0.5T的脉冲磁场，脉冲频率设置为1-5Hz，占空比为30%，磁场方向垂直于流体流动方向，使纳米磁性粒子在反应腔内产生受控微运动，从而增加其与溶液中免疫复合物的碰撞概率； 在脉冲磁场作用下，纳米磁性粒子表面的特异性抗体抗原与溶液中已形成的免疫复合物发生高亲和力结合，同时未被占据的特异性抗体抗原位点捕获溶液中的目标分析物，形成“纳米磁性粒子-抗原抗体-双酶标记二抗”三明治结构的完整免疫复合物； 随着捕获反应的进行，通过微流控芯片内置的电子自旋共振微型传感器实时监测磁性粒子的聚集状态与流动性变化，当信号稳定后，将脉冲磁场强度逐渐降低至0.1T，频率降至0.5Hz，进行为期2分钟的低强度稳定化处理； 捕获反应完成后，注入pH7.4、含0.1%BSA和0.01%吐温-20的PBS溶液，流速控制在8-10μLmin，同时保持0.05T的稳定磁场，确保磁性粒子保持在反应腔内，而非特异性结合物和未结合组分被洗脱； 使用5-10倍放大倍率对反应腔内的磁性免疫复合物进行实时观察和记录，结合图像分析算法评估复合物形成效率，当分析参数达到预设标准时，自动进入下一步骤，确保免疫复合物的质量和数量满足后续检测需求。

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