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龙图腾网获悉赛业(苏州)生物科技有限公司;广州赛业百沐生物科技有限公司申请的专利一种构建人源化DEB小鼠模型的方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN118421700B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-09-09发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202410508521.1，技术领域涉及：C12N15/85；该发明授权一种构建人源化DEB小鼠模型的方法是由牟星;徐婧语设计研发完成，并于2024-04-26向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种构建人源化DEB小鼠模型的方法在说明书摘要公布了：本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，公开了一种构建人源化大疱性表皮松解症DEB小鼠模型的方法，及其在生物医药的应用。所述方法包括以下步骤：使用小鼠ES胚胎干细胞制备基因工程小鼠，并以人COL7A1基因组序列或其突变序列替换小鼠全长Col7a1基因序列；优选的，所述人COL7A1基因组序列如hg19:chr3:48,635,720‑48,603,572所示；所述人COL7A1基因组突变序列如hg19:chr3:48,635,720‑48,603,572c.6527dupC所示；本发明构建的突变型动物可以存活7‑10d，与已报道敲除小鼠Col7a1‑‑中位生存期存活2d相比，可在不用药物维持的基础上显著增加生存期，给治疗实验提供了更长的窗口期。

本发明授权一种构建人源化DEB小鼠模型的方法在权利要求书中公布了：1.一种构建人源化DEB小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）构建打靶载体I，打靶载体包含5arm同源臂序列、Puro抗性筛选元件、1.9KbKI序列及3arm同源臂序列； 所述1.9KbKI序列包括部份人114号内含子序列、115号外显子到3’UTR的所有基因组序列，所述1.9KbKI序列通过基因合成获取； 所述1.9KbKI序列如SEQIDNo.6所示； 所述Puro两侧分别带有一个lox2272和loxP元件； 所述同源臂序列从C57BL6小鼠的基因组中进行扩增获取； （2）构建打靶Bac载体II，人COL7A1基因上游3kb处插入与打靶载体I同向的lox2272重组酶位点，在人COL7A1基因114号内含子中插入与打靶载体I同向的loxP重组酶位点；且人COL7A1基因与loxP之间包含一个Neo抗性筛选元件，Neo两侧带有Rox序列,其中BAC是RP11-118J3； 所述插入人源基因组序列为hg19:chr3:48,635,720-48,603,572； （3）将构建好的打靶载体I电转到C57BL6品系的ES细胞中，细胞经过Puromycin药物筛选，挑取药物抗性的ES克隆，相关ES克隆进行培养、扩增后进行PCR分型鉴定及Southern鉴定，获得正确打靶的阳性ES细胞I； （4）将构建好的Bac载体II电转到ES细胞I中，细胞经过G418药物筛选，挑取药物抗性的ES克隆，相关ES克隆进行培养、扩增后进行PCR分型鉴定及Southern鉴定，获得正确打靶的阳性ES细胞II； （5）将阳性ES细胞II注射入囊胚中，再将囊胚移植到代孕鼠内，通过20天左右的孕期，小鼠出生； （6）剪取5-7d的幼鼠鼠爪，提取DNA，进行PCR分型鉴定确认小鼠基因型； （7）待雄性Founder小鼠到8周龄与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生7天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞； （8）待雄性F1小鼠到8周龄，雌性F1小鼠到6周龄，进行相互配种，F2小鼠出生7天后PCR鉴定，确认纯合子小鼠的出生； （9）将COL7A1纯合子小鼠进行表型分析，观察小鼠皮肤表征； （10）构建打靶载体III,在打靶载体II的基础上引入突变c.6527dupC； （11）将构建好的打靶载体III电转到阳性细胞细胞I中，细胞经过G418药物筛选，挑取药物抗性的ES克隆，相关ES克隆进行培养、扩增后进行PCR分型鉴定及Southern鉴定，获得正确打靶的阳性ES细胞III； （12）将阳性ES细胞III注射入囊胚中，再将囊胚移植到代孕鼠内，通过20天左右的孕期，小鼠出生； （13）剪取5-7d的幼鼠鼠爪，提取DNA，进行PCR分型鉴定确认小鼠基因型； （14）待雄性Founder小鼠到8周龄与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生7天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞； （15）待雄性F1小鼠到8周龄，雌性F1小鼠到6周龄，进行相互配种，F2小鼠出生7天后PCR鉴定，确认纯合子小鼠的出生； （16）将hCOL7A1c.6527dupC小鼠纯合子小鼠进行表型分析，观察小鼠皮肤表征。

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