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龙图腾网获悉北京大学申请的专利一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115466780B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-08-15发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202110647509.5，技术领域涉及：C12Q1/6818；该发明授权一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法是由陈匡时;吴若楠;秦金珊;吴小天设计研发完成，并于2021-06-10向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法在说明书摘要公布了：本发明公开了一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法，通过改造sgRNA的SL2区域使Cas9蛋白能够固定于玻片上并且保持功能，并对Cas9蛋白的突变型C80SS355CC574SS867C进行FRET荧光对标记，从而能够基于单分子荧光共振能量转移真实地反映Cas9构象状态，为体外研究CRISPRCas9体系的结构‑功能关系提供了有效手段，对设计具有优化性质的Cas9并使其发挥新的功能具有重要意义。

本发明授权一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法在权利要求书中公布了：1.一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法，包括： 1）在sgRNA的SL2区域中插入一段特殊序列TS，使其可与生物素修饰的寡核苷酸biotin-oligo杂交互补，并通过体外转录获得改造后的sgRNA，命名为SL2-sgRNA-TS；其中，所述TS是与sgRNA无关的序列，其长度为20~60nt； 2）制备生物素修饰的寡核苷酸biotin-oligo，该寡核苷酸含有与TS杂交互补的序列； 3）制备Cas9蛋白或dCas9蛋白的突变型C80SS355CC574SS867C，并对突变型蛋白进行FRET荧光对标记； 4）制备靶标双链DNA，该靶标双链DNA含有与SL2-sgRNA-TS的spacer序列互补的靶标序列及与其相邻的PAM序列； 5）在盖玻片表面修饰上带有生物素的聚乙二醇Biotin-PEG，获得功能化盖玻片，然后在该功能化盖玻片表面孵育中性亲和素，使之与盖玻片表面的Biotin-PEG结合；再在修饰有中性亲和素的功能化盖玻片上孵育步骤2）制备的biotin-oligo，通过生物素与中性亲和素的反应将biotin-oligo连接在盖玻片上； 6）将步骤3）制备的Cas9蛋白或dCas9蛋白的突变型与步骤1）获得的SL2-sgRNA-TS在体外混合孵育，其中蛋白与sgRNA的摩尔比大于5:1，形成Cas9sgRNA复合物或dCas9sgRNA复合物；同时，将Cas9蛋白或dCas9蛋白的突变型与SL2-sgRNA-TS、靶标双链DNA在体外混合孵育，其中蛋白与sgRNA摩尔比大于5:1，靶标双链DNA与sgRNA摩尔比大于2:1，形成Cas9sgRNADNA复合物或dCas9sgRNADNA复合物； 7）分别将步骤6）获得的复合物在步骤5）获得的盖玻片上孵育，通过biotin-oligo与SL2-sgRNA-TS中TS的杂交互补，将复合物特异性连接在盖玻片表面； 8）通过全内反射荧光显微镜采集步骤7）处理后的盖玻片表面的单分子FRET荧光信号，通过对单分子FRET效率的分析来解析Cas9或dCas9在不同状态下的构象变化。

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